Нативная структура. Третичная структура белков. Особенности строения антител

Третичной структурой белка называется способ укладки полипептидной цепи в трехмерном пространстве. Такая конформация возникает за счет образования химических связей между удаленными друг от друга аминокислотными радикалами. Этот процесс осуществляется при участии молекулярных механизмов клетки и играет огромную роль в придании белкам функциональной активности.

Особенности третичной структуры

Для третичной структуры белков характерны следующие типы химических взаимодействий:

• ионные;
• водородные;
• гидрофобные;
• ван-дер-ваальсовы;
• дисульфидные.

Все эти связи (кроме ковалентной дисульфидной) очень слабые, однако за счет количества стабилизируют пространственную форму молекулы.

Фактически третий уровень укладки полипептидных цепей представляет собой комбинацию различных элементов вторичной структуры (α-спиралей; β-складчатых слоев и петель), которые ориентируются в пространстве за счет химических взаимодействий между боковыми аминокислотными радикалами. Для схематичного обозначения третичной структуры белка α-спирали обозначаются цилиндрами или спирально закрученными линиями, складчатые слои — стрелками, а петли — простыми линиями.

Характер третичной конформации определяется последовательностью аминокислот в цепи, поэтому двум молекулам с одинаковой первичной структурой при равных условиях будет соответствовать один и тот же вариант пространственной укладки. Такая конформация обеспечивает функциональную активность белка и называется нативной.

В процессе укладки белковой молекулы происходит сближение компонентов активного центра, которые в первичной структуре могут быть значительно удалены друг от друга.

Для одноцепочечных белков третичная структура является конечной функциональной формой. Сложные многосубъединичные белки образуют четвертичную структуру, которая характеризует расположение нескольких цепей по отношению друг к другу.

Характеристика химических связей в третичной структуре белка

В значительной степени сворачивание полипептидной цепи обусловлено соотношением гидрофильных и гидрофобных радикалов. Первые стремятся вступить во взаимодействие с водородом (составным элементом воды) и потому находятся на поверхности, а гидрофобные участки наоборот устремляются в центр молекулы. Такая конформация энергетически наиболее выгодна. В результате формируется глобула с гидрофобной сердцевиной.

Гидрофильные радикалы, которые все же попадают в центр молекулы, взаимодействуют друг с другом с образованием ионных или водородных связей. Ионные связи могут возникать между противоположно заряженными аминокислотными радикалами, в качестве которых выступают:

• катионные группы аргинина, лизина или гистидина (имеют положительный заряд);
• карбоксильные группы радикалов глутаминовой и аспарагиновой кислоты (имеют отрицательный заряд).

Водородные связи образуются при взаимодействии незаряженных (OH, SH, CONH 2) и заряженных гидрофильных групп. Ковалентные связи (самые прочные в третичной конформации) возникают между SH-группами цистеиновых остатков, формируя так называемые дисульфидные мостики. Обычно эти группы удалены друг от друга в линейной цепи и сближаются только в процессе укладки. Дисульфидные связи не характерны для большинства внутриклеточных белков.

Конформационная лабильность

Так как связи, формирующие третичную структуру белка, очень слабые, броуновское движение атомов в аминокислотной цепи может привести к их разрыву и образованию в новых местах. Это приводит к незначительному изменению пространственной формы отдельных участков молекулы, но не нарушает нативную конформацию белка. Такое явление называют конформационной лабильностью. Последняя играет огромную роль в физиологии клеточных процессов.

На конформацию белка влияют его взаимодействия с другими молекулами или изменения физико-химических параметров среды.

Как образуется третичная структура белка

Процесс укладки белка в нативную форму называется фолдингом. В основе этого явления лежит стремление молекулы принять конформацию с минимальным значением свободной энергии.

Ни один белок не нуждается в посредниках-инструкторах, которые будут определять третичную структуру. Схема укладки изначально "записана" в последовательности аминокислот.

Однако при обычных условиях, для того чтобы крупная белковая молекула приняла нативную конформацию соответственно первичной структуре, ей потребовалось бы более триллиона лет. Тем не менее в живой клетке этот процесс длится всего лишь несколько десятков минут. Столь значительное сокращение времени обеспечивается участием в фолдинге специализированных вспомогательных белков — фолдаз и шаперонов.

Сворачивание маленьких белковых молекул (до 100 аминокислот в цепи) происходит достаточно быстро и без участия посредников, что показали эксперименты in vitro.

Факторы фолдинга

Участвующие в фолдинге вспомогательные белки делятся на две группы:

• фолдазы — обладают каталитической активностью, требуются в количестве, значительно уступающем концентрации субстрата (как и другие ферменты);
• шапероны — белки с разнообразными механизмами действия, нужны в концентрации, сопоставимой с количеством сворачиваемого субстрата.

Оба типа факторов участвуют в фолдинге, но не входят в состав конечного продукта.

Группу фолдаз представляют 2 фермента:

• Протеиндисульфидизомераза (ПДИ) — контролирует правильное образование дисульфидных связей в белках с большим количеством остатков цистеина. Эта функция очень важна, поскольку ковалентные взаимодействия очень прочные, и в случае возникновения ошибочных соединений белок не смог бы самостоятельно перестроиться и принять нативную конформацию.
• Пептидил-пролил-цис-транс-изомераза — обеспечивает изменение конфигурации радикалов, расположенных по бокам от пролина, что изменяет характер изгиба полипептидной цепи на этом участке.

Таким образом, фолдазы выполняют корректирующую роль в образовании третичной конформации белковой молекулы.

Шапероны

Шапероны иначе называются или стресса. Это связано со значительным увеличением их секреции при отрицательных воздействиях на клетку (температура, радиация, тяжелые металлы и т. д.).

Шапероны принадлежат к трем семействам белков: hsp60, hsp70 и hsp90. Эти протеины выполняют множество функции, включая:

• защиту белков от денатурации;
• исключение взаимодействия только что синтезированных белков друг с другом;
• предупреждение образования неправильных слабых связей между радикалами и их лабиализация (исправление).

Таким образом, шапероны способствуют быстрому приобретению энергитически правильной конформации, исключая случайный перебор множества вариантов и ограждая еще не созревшие белковые молекулы от ненужного взаимодействия друг с другом. Кроме этого, шапероны обеспечивают:

• некоторые виды транспортировки белков;
• контроль рефолдинга (восстановления третичной структуры после ее утраты);
• поддержание состояния неоконченного фолдинга (для некоторых белков).

В последнем случае молекула шаперона остается связанной с белком по завершении процесса укладки.

Денатурация

Нарушение третичной структуры белка под воздействием каких-либо факторов называется денатурацией. Потеря нативной конформации происходит при разрушении большого количества слабых связей, стабилизирующих молекулу. При этом белок теряет свою специфическую функцию, но сохраняет первичную структуру (пептидные связи во время денатурации не разрушаются).

При денатурации происходит пространственное увеличение белковой молекулы, а гидрофобные участки вновь выходят на поверхность. Полипептидная цепь приобретает конформацию беспорядочного клубка, форма которого зависит от того, какие связи третичной структуры белка были разорваны. В таком виде молекула более восприимчива к воздействию протеолитических ферментов.

Факторы, нарушающие третичную структуру

Существует целый ряд физико-химических воздействий, способных вызвать денатурацию. К ним относят:

• температуру выше 50 градусов;
• радиацию;
• изменение pH среды;
• соли тяжелых металлов;
• некоторые органические соединения;
• детергенты.

После прекращения денатурирующего воздействия белок может восстановить третичную структуру. Этот процесс называется ренатурацией или рефолдингом. В условиях in vitro такое возможно только для небольших белков. В живой клетке рефолдинг обеспечивают шапероны.

Рис. 3.9. Третичная структура лактоглобулина - типичного а/р-белка (по PDB-200I) (Brownlow, S., Marais Cabral, J. H., Cooper, R., Flower, D. R., Yewdall, S. J., Polikarpov, I., North, A. C., Sawyer, L.: Structure, 5, p. 481. 1997)

Пространственная структура зависит не от длины полипептидной цепи, а от последовательности аминокислотных остатков, специфичной для каждого белка, а также от боковых радикалов, свойственных соответствующим аминокислотам. Пространственную трехмерную структуру или конформацию белковых макромолекул образуют в первую очередь водородные связи, а также гидрофобные взаимодействия между неполярными боковыми радикалами аминокислот. Водородные связи играют огромную роль в формировании и поддержании пространственной структуры белковой макромолекулы. Водородная связь образуется между двумя электроотрицательными атомами посредством протона водорода, ковалентно связанного с одним из этих атомов. Когда единственный электрон атома водорода участвует в образовании электронной пары, то протон притягивается соседним атомом, образуя водородную связь. Обязательным условием образования водородной связи является наличие хотя бы одной свободной пары электронов у электроотрицательного атома. Что касается гидрофобных взаимодействий, то они возникают в результате контакта между неполярными радикалами, неспособными разорвать водородные связи между молекулами воды, которая вытесняется на поверхность белковой глобулы. По мере синтеза белка неполярные химические группировки собираются внутри глобулы, а полярные вытесняются на ее поверхность. Таким образом, белковая молекула может быть нейтральной, заряженной положительно или же отрицательно в зависимости от pH растворителя и ионогенных групп в белке. К слабым взаимодействиям относят также ионные связи и ван-дер-ваальсовы взаимодействия. Кроме того, конформация белков поддерживается ковалентными связями S-S, образующимися между двумя остатками цистеина. В результате гидрофобных и гидрофильных взаимодействий молекула белка спонтанно принимает одну или несколько наиболее термодинамически выгодных конформаций, причем, если в результате каких-либо внешних воздействий нативная конформация нарушается, возможно полное или почти полное ее восстановление. Впервые это показал К. Анфинсен на примере каталитически активного белка рибонуклеазы. Оказалось, что при воздействии мочевиной или p-меркаптоэтанолом происходит изменение ее конформации и, как следствие, резкое снижение каталитической активности. Удаление мочевины приводит к переходу конформации белка в исходное состояние, и каталитическая активность восстанавливается.

Таким образом, конформация белков представляет собой трехмерную структуру, причем в результате ее образования многие атомы, находящиеся на удаленных участках полипептидной цепи, сближаются и, воздействуя друг на друга, приобретают новые свойства, отсутствующие у индивидуальных аминокислот или небольших полипептидов. Это так называемая третичная структура , характеризующаяся ориентацией полипептидных цепей в пространстве (рис. 3.9). Третичная структура глобулярных и фибриллярных белков существенно отличается друг от друга. Принято форму белковой молекулы характеризовать таким показателем, как степень асимметрии (отношение длинной оси молекулы к короткой). У глобулярных белков степень асимметрии равна 3-5, что касается фибриллярных белков, то эта величина у них гораздо больше (от 80 до 150).

Каким же образом первичная и вторичная развернутые структуры преобразуются в свернутую, весьма стабильную форму? Расчеты показывают, что число теоретически возможных комбинаций образования трехмерных структур белков неизмеримо больше, чем реально существующих в природе. По-видимому, основным фактором конформационной стабильности являются энергетически наиболее выгодные формы.

Гипотеза расплавленной глобулы. Одним из способов изучения сворачивания полипептидной цепи в трехмерную структуру является денатурация и последующая рснатурация белковой молекулы.

Опыты К. Анфинсена с рибонуклеазой однозначно показывают возможность сборки именно той пространственной структуры, которая была нарушена в результате денатурации (рис. 3.10).

В данном случае восстановление нативной конформации не требует наличия никаких дополнительных структур. Какие же модели свертывания полипептидной цепи в соответствующую конформацию являются наиболее вероятными? Одной из распространенных гипотез самоорганизации белка является гипотеза расплавленной глобулы. В рамках этой концепции выделяют несколько этапов самосборки белков.

• 1. В развернутой полипептидной цепи с помощью водородных связей и гидрофобных взаимодействий образуются отдельные участки вторичной структуры, служащие как бы затравками для формирования полных вторичных и супервторичных структур.
• 2. Когда число этих участков достигает определенной пороговой величины, происходит переориентация боковых радикалов и переход полипептидной цепи в новую более компактную форму, причем число нековалентных связей

Рис. 3.10.

значительно увеличивается. Характерной особенностью этой стадии является образование специфических контактов между атомами, находящимися на удаленных участках полипептидной цепи, но оказавшихся сближенными в результате образования третичной структуры.

3. На последнем этапе формируется нативная конформация белковой молекулы, связанная с замыканием дисульфидных связей и окончательной стабилизацией белковой конформации. Не исключена также неспецифическая агрегация частично сверну

тых полипсптидных цепей, что можно квалифицировать как ошибки образования нативных белков. Частично свернутая полипептидная цепь (этап 2) называется расплавленной глобулой, а этап 3 является самым медленным при образовании зрелого белка.

На рис. 3.11 показан вариант образования белковой макромолекулы, кодируемой одним геном. Известно, однако, что ряд белков, имеющих домен-

Рис. 3.11.

(по Н. К. Наградовой) ную структуру, формируется в результате дубликации генов, и образование контактов между отдельными доменами требует дополнительных усилий. Оказалось, что в клетках имеются специальные механизмы регуляции процессов сворачивания новосинтезиро- ванных белков. В настоящее время обнаружено два фермента, участвующих в реализации этих механизмов. Одной из медленных реакций третьего этапа сворачивания полипептидных цепей является *

Рис. 3.12.

Кроме того, в клетках имеется ряд каталитически неактивных белков, которые тем не менее вносят большой вклад в образование пространственных структур белков. Это так называемые шапероны и шаперонины (рис. 3.12). Один из первооткрывателей молекулярных шаперонов, Л. Эллис, называет их функциональным классом не связанных друг с другом семейств белков, которые помогают правильной нековалентной сборке других полипептидсодержа- ших структур in vivo, но не входят в состав собираемых структур и не участвуют в реализации их нормальных физиологических функций.

Шапероны помогают правильной сборке трехмерной белковой конформации путем образования обратимых нековалентных комплексов с частично свернутой полипептидной цепью, одновременно ингибируя неправильно образованные связи, ведущие к формированию функционально неактивных белковых структур. В перечень функций, свойственных шаперонам, входит защита расплавленных глобул от агрегации, а также перенос новосинтезированных белков в различные локусы клеток. Шапероны преимущественно являются белками теплового шока, синтез которых резко усиливается при стрессовом температурном воздействии, поэтому их называют еще hsp (heat shock proteins). Семейства этих белков найдены в микробных, растительных и животных клетках. Классификация шаперонов основана на их молекулярной массе, которая варьирует от 10 до 90 kDa. В основном функции шаперонов и шаперо- нинов различаются, хотя и те, и другие являются белками-помошниками процессов образования трехмерной структуры белков. Шапероны удерживают новосинтсзированную полипептидную цепь в развернутом состоянии, не давая ей свернуться в отличную от нативной форму, а шаперонины обеспечивают условия для образования единственно правильной, нативной структуры белка (рис. 3.13).

Рис. 3.13.

Шапероны / связаны с нансцентной полипептидной цепью, сходящей с рибосомы. После образования полипептидной цепи и выхода ее из рибосомы шапероны соединяются с ней и препятствуют агрегации 2. После сворачивания в цитоплазме белки отделяются от шаперона и переходят на соответствующий шаперо- нин, где и происходит окончательное образование третичной структуры 3. При помощи цитозольного шаперона белки перемещаются к внешней мембране митохондрии, где митохондриальный шапе- рон протягивает их вовнутрь митохондрий и «передает» митохондриальному шаперонину, где и происходит сворачивание 4, а 5 аналогично 4 , но применительно к эндоплазматическому ретикулуму.

Нативные и ненативные белки

Нативные белки - это те, которые содержат все незаменимые аминокислоты, необходимые организму для строительства и восстановления мышц и органов.

Ненативные белки - это те, которые содержат только некоторые из аминокислот, но тем не менее обладают значительной пищевой ценностью.

Нативные белки есть в мясе, рыбе, морепродуктах, птице, яйцах и сыре. Они богаты также витаминами группы В.

Ненативные белки содержатся в зерновых, бобовых, орехах, семечках и некоторых листовых овощах. А также в ореховом масле, таком как арахисовое, миндальное и кешью.

Ненативные белки полезно есть в сочетании с другими продуктами. Употребляя в пищу сочетания определенных ненативных белков, можно получить за один прием все незаменимые аминокислоты.